1919년 3·1운동 때 기독교를 대표하는 민족대표 33인 중 1인으로 독립선언서(獨立宣言書)에 서명하였다. 길선주는 1919년 2월 14일 기홀병원(記笏病院)에서 서울에서 내려온 이승훈(李昇薰)에게 3·1운동에 대한 계획을 전해 듣고 이에 적극 찬동하여 경성으로 가서 독립운동의 협의에 참여하기로 하였다. 그러나 평양에서 여러 가지 활동으로 참여하지 못하고, 그의 도장을 이승훈(李昇薰)에게 맡겼다. 3월 1일 당일 길선주는 평양에서 서울로 올라오는 관계로 지체되었기 때문에 김병조(金秉祚), 유여대(劉如大), 정춘수(鄭春洙) 등과 함께 태화관 독립선언서 낭독 모임에 참가하지 못하였다. 하지만 그는 서울에 도착한 즉시 곧바로 종로경찰서로 달려가 동지들과 운명을 같이 하였다. 이후 길선주는 1920년 8월 9일 경성지방법원에서 소위 보안법 위반 등으로 무죄 석방될 때까지 옥고를 치렀다.

정부는 고인의 공훈을 기려 2009년에 건국훈장 독립장을 추서하였다.

• 宗敎時報(1936. 1. 14)
• pyengyang news(1936. 4)
• 독립운동사자료집(독립운동사편찬위원회) 제6집 394~400면
• 獨立宣言文(1919. 3. 1)
• 豫審終結決定(京城地方法院：1919. 9. 1)
• 判決文(京城地方法院：1920. 8. 9)
• 判決文(京城覆審法院：1920. 10. 30)
• 中外日報(1928. 6. 5)
• 弔辭(宋鎭禹, 1935. 12. 3)
• 豫審終結決定(高等法院特別刑事部：1920. 3. 22)
• 東亞日報(1935. 11. 27·11. 28·11. 30, 12. 4·12. 5)